Une suppression de 81 nucléotides dans le SRAS-CoV-2 ORF7a identifiée à partir de la surveillance sentinelle en Arizona (janvier-mars 2020)
https://doi.org/10.1128/JVI.00711-20
Copie et tradution
An 81 nucleotide deletion in SARS-CoV-2 ORF7a identified from sentinel surveillance in Arizona (Jan-Mar 2020)
JVI Accepted Manuscript Posted Online 1 May 2020
- Virol. doi:10.1128/JVI.00711-20
Copyright © 2020 Holland et al.
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On January 26 2020, the first Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) case was reported in Arizona (3rd 24 case in the US) (1). Here, we report on early SARS-CoV-2 sentinel surveillance inTempe, Arizona (USA). Genomic characterization identified an isolate encoding a 27 amino acid in-frame deletion in accessory protein ORF7a, the ortholog of SARS-CoV immune antagonist ORF7a/X4.
In anticipation of COVID-19 spreading in Arizona, we initiated a surveillance effort for local emergence of SARS-CoV-2 starting January 24, 2020. We leveraged an ongoing influenza surveillance project at Arizona State University (ASU) Health Services in Tempe, Arizona. Individuals presenting with respiratory symptoms (ILI) were tested for influenza A and B virus (Alere BinaxNOW). Subsequently, we tested influenza-negative nasopharyngeal (NP) swabs for SARS-CoV-2.We extracted total nucleic acid using the bioMérieux eMAG automated platform and performed real-time RT-PCR (qRT-PCR) assays specific for SARS-CoV-2 N and E genes (2, 3). Out of 382 NP swabs collected from January 24 to March 25, 2020, we detected SARS- CoV-2 in 5 swabs in the week of March 16 to 19 (Figure 1). This corresponds to prevalence of 1.31%. Given the estimated 1– 14-day incubation period for COVID-19, the spike in cases might be related to university spring-break holiday travel (March 8– 15) as previously seen in other outbreaks (4, 5).
To understand the evolutionary relationships and characterize the SARS-CoV-2 genomes, we performed next-generation sequencing (Illumina NextSeq, 2x76) directly on specimen RNA, thereby avoiding cell culture passage and potentially associated mutations. This generated an NGS dataset of 20.7 to 22.7 million paired-end reads per sample. We mapped quality-filtered reads to a reference SARS-CoV-2 genome (MN908947) using BBMap (version 39.64) to generate three full-length genomes: AZ-ASU2922 (376x coverage), AZ-ASU2923 (50x) and AZ- ASU2936 (879x) (Geneious prime version 2020.0.5).
We aligned a total of 222 SARS-CoV-2 genome sequences comprising at least 5 representative sequences from phylogenetic lineages on May 5, 2020 by guest http://jvi.asm.org/ Downloaded from 3 defined by Rambaut et al. (6). We performed phylogenetic reconstruction with BEAST (version 1.10.4, strict molecular clock, HKY + nucleotide substitution, exponential growth for coalescent model) (7-10).
The ASU sequences were phylogenetically distinct, indicating independent transmissions (Figure 2A). Like SARS-CoV, the SARS-CoV-2 genome encodes multiple open reading frames in the 3' region. We found that the SARS-CoV-2 AZ-ASU2923 genome has an 81 nucleotide deletion in the ORF7a gene resulting in a 27 amino-acid in-frame deletion (Figure 2B). The SARS-CoV ORF7a ortholog is a viral antagonist of host restriction factor BST-2/Tetherin and induces apoptosis (11-14). Based on the SARS-CoV ORF7a structure (15), the 27-aa deletion in SARS-57 CoV-2 ORF7a maps to the putative signal peptide (partial) and first two beta strands. To validate the deletion, we performed RT-PCR using primers spanning the region and verified by Sanger sequencing the amplicons (Figure 2C). Similar deletions in SARS-CoV-2 genomes are emerging, notably in the ORF8 gene (16) that may potentially reduce virus fitness (17). Hence, further experiments are needed to determine the functional consequences of the ORF7a deletion. Collectively, although global NGS efforts indicate that SARS-CoV-2 genomes are relatively stable, dynamic mutations can be selected in symptomatic individuals.
Le 26 janvier 2020, le premier cas de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a été signalé dans l’Arizona (3e cas sur 24 aux États-Unis) (1). Ici, nous faisons le point sur la surveillance sentinelle précoce du SRAS-CoV-2 à Tempe, en Arizona (États-Unis). La caractérisation génomique a permis d'identifier un isolat codant pour une délétion de 27 acides aminés dans le cadre de la protéine accessoire ORF7a, l'orthologue de l'antagoniste immunitaire ORF7a/X4 du SRAS-CoV.
En prévision de la propagation de COVID-19 en Arizona, nous avons lancé un effort de surveillance pour l'émergence locale de SARS-CoV-2 à partir du 24 janvier 2020. Nous avons tiré parti d'un projet de surveillance de la grippe en cours aux services de santé de l'Université d'État de l'Arizona (ASU) à Tempe, en Arizona. Les personnes présentant des symptômes respiratoires (ILI) ont été testées pour le virus de la grippe A et B (Alere BinaxNOW). Par la suite, nous avons testé des écouvillons nasopharyngés (NP) négatifs pour le SRAS-CoV-2. Nous avons extrait l'acide nucléique total en utilisant la plateforme automatisée de bioMérieux eMAG et effectué des tests RT-PCR en temps réel (qRT-PCR) spécifiques aux gènes N et E du SRAS-CoV-2 (2, 3). Sur les 382 écouvillons de NP collectés du 24 janvier au 25 mars 2020, nous avons détecté le SRAS-CoV-2 dans 5 écouvillons au cours de la semaine du 16 au 19 mars (figure 1). Cela correspond à une prévalence de 1,31 %. Compte tenu de la période d'incubation estimée à 1-14 jours pour le COVID-19, le pic de cas pourrait être lié aux voyages universitaires pendant les vacances de printemps (8-15 mars), comme on l'a vu précédemment dans d'autres foyers (4, 5).
Pour comprendre les relations évolutives et caractériser les génomes du SRAS-CoV-2, nous avons effectué un séquençage de nouvelle génération (Illumina NextSeq, 2x76) directement sur l'ARN de l'échantillon, évitant ainsi le passage de la culture cellulaire et les mutations potentiellement associées. Cela a généré un ensemble de données NGS de 20,7 à 22,7 millions de lectures de paires par échantillon. Nous avons mis en correspondance des lectures filtrées de qualité avec un génome de référence SARS-CoV-2 (MN908947) en utilisant BBMap (version 39.64) pour générer trois génomes complets : AZ-ASU2922 (couverture 376x), AZ-ASU2923 (50x) et AZ- ASU2936 (879x) (Geneious prime version 2020.0.5).
Nous avons aligné un total de 222 séquences du génome du SRAS-CoV-2 comprenant au moins 5 séquences représentatives de lignées phylogénétiques le 5 mai 2020 par l'invité http://jvi.asm.org/ Téléchargé à partir de 3 définies par Rambaut et al. (6). Nous avons effectué une reconstruction phylogénétique avec BEAST (version 1.10.4, horloge moléculaire stricte, HKY + substitution de nucléotides, croissance exponentielle pour le modèle coalescent) (7-10).
Les séquences ASU étaient phylogénétiquement distinctes, indiquant des transmissions indépendantes (figure 2A). Comme le SARS-CoV, le génome du SARS-CoV-2 encode plusieurs cadres de lecture ouverts dans la région 3'. Nous avons constaté que le génome du SARS-CoV-2 AZ-ASU2923 présente une délétion de 81 nucléotides dans le gène ORF7a, ce qui entraîne une délétion de 27 acides aminés dans le cadre de lecture (figure 2B). L'orthologue ORF7a du SRAS-CoV est un antagoniste viral du facteur de restriction de l'hôte BST-2/Tetherin et induit l'apoptose (11-14). Sur la base de la structure de l'ORF7a du CoV SRAS (15), la délétion 27-aa dans l'ORF7a du CoV-2 SRAS-57 correspond au peptide signal supposé (partiel) et aux deux premiers brins bêta. Pour valider la délétion, nous avons effectué une RT-PCR en utilisant des amorces couvrant la région et vérifiées par le séquençage de Sanger des amplicons (figure 2C). Des délétions similaires dans les génomes du SRAS-CoV-2 apparaissent, notamment dans le gène ORF8 (16) qui pourrait potentiellement réduire l'aptitude du virus (17). Par conséquent, d'autres expériences sont nécessaires pour déterminer les conséquences fonctionnelles de la délétion de l'ORF7a. Collectivement, bien que les efforts mondiaux en matière de NGS indiquent que les génomes du SRAS-CoV-2 sont relativement stables, des mutations dynamiques peuvent être sélectionnées chez les individus symptomatiques.
Acknowledgements
We thank the nurses and staff at the ASU Health Services, Arizona Department of Health Services for a SARS-CoV-2 positive sample (AZ_4811) for qRT-PCR assay validation experiments, Nicholas Mellor and the ASU Genomics Facility for technical assistance, the authors, originating and submitting laboratories of the sequences from GISAID’s EpiCoV™ Database. A complete acknowledgements table is available at on May 5, 2020 by guest http://jvi.asm.org/ Downloaded from 4 https://www.dropbox.com/s/aiybuatgxjunuga/GISAID_CoV2020_Acknowledgements.xlsx?dl=0 .
This work was supported by NSF STC Award 1231306 (B.G.H), NIH grants R01 LM013129 (R.U.H., A.V., M.S.), R00 DK107923 (E.S.L.), J.M. Kaplan Foundation’s One Water One Health (Arizona State University Foundation project 30009070) and ASU Core Facilities Seed Funding.