Les bactéries intestinales peuvent-elles provoquer l'autisme (chez la souris) ?

Une critique d'une recherche suivant laquelle les microbes présents dans l'intestin contribueraient au développement de l'autisme.

Can gut bacteria cause autism (in mice)? Jon Brock - 14 juin 2019

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Il y a deux semaines, un article publié dans la revue Cell prétendait apporter la preuve que les microbes présents dans l'intestin contribuent au développement de l'autisme. Les chercheurs, dirigés par Gil Sharon et Sarkis Mazmanian du California Institute of Technology, ont découvert que les souris ayant des bactéries intestinales provenant d'enfants autistes présentaient des comportements plus "autistiques" que les souris dont les bactéries intestinales provenaient d'enfants non autistes.

"Nous avons transplanté des microbiotes intestinaux provenant de donneurs humains autistes ou de témoins de la dysenterie intestinale sur des souris sans germes et nous avons découvert que la colonisation par des microbiotes autistes est suffisante pour induire des comportements autistiques caractéristiques."

Le résultat, s'il est vrai, pourrait avoir des implications importantes pour la compréhension des causes de l'autisme et, potentiellement, de son traitement. Il n'est pas surprenant que l'étude ait fait l'objet d'une large couverture médiatique, notamment d'articles dans le Guardian et l'Economist.

Mais peu après la publication, les scientifiques ont commencé à exprimer leurs inquiétudes concernant le rapport sur les médias sociaux. Le chimiste Derek Lowe, spécialiste de la découverte de médicaments, s'est fait l'écho de ces préoccupations dans un blog, puis dans une série de commentaires sur le site PubPeer. Si l'on examine les données de plus près, les résultats sont beaucoup moins convaincants que ne le suggèrent la couverture médiatique, les communiqués de presse et même le document lui-même.

Qu'ont donc trouvé exactement les chercheurs ? Et pourquoi ce scepticisme ?

L'idée que les bactéries intestinales jouent un rôle dans l'autisme n'est pas en soi invraisemblable. Les problèmes gastro-intestinaux sont courants chez les autistes et de nombreuses études portant sur des échantillons de selles d'enfants et d'adultes autistes ont mis en évidence des différences dans les bactéries qui colonisent leur système digestif. Au début de cette année, une revue systématique a identifié 16 études de "qualité moyenne à élevée" avec un total de 381 personnes autistes et 283 témoins non autistes. Elle a conclu qu'il existe des différences assez constantes dans le microbiome intestinal des personnes atteintes d'autisme :

"Le changement global de la communauté bactérienne intestinale en termes de β-diversité a été constamment observé chez les patients atteints de TSA [troubles du spectre autistique] par rapport aux HC [témoins sains]. En outre, les concentrations de Bifidobacterium, Blautia, Dialister, Prevotella, Veillonella et Turicibacter étaient systématiquement réduites, tandis que celles de Lactobacillus, Bacteroides, Desulfovibrio et Clostridium étaient augmentées chez les patients atteints d'un TSA par rapport aux patients atteints de maladies chroniques dans certaines études.

Mais le fait de découvrir que l'autisme est associé à des bactéries intestinales altérées ne signifie pas nécessairement que ces bactéries causent l'autisme. Les personnes autistes ont souvent un régime alimentaire assez restreint, qui pourrait lui-même affecter les microbes intestinaux. De plus, il est de plus en plus évident que les différences génétiques affectant le développement du cerveau peuvent également avoir un impact sur le fonctionnement de l'intestin. En d'autres termes, les différences entre les bactéries intestinales pourraient ne pas expliquer pourquoi les gens sont autistes. Elles peuvent survenir parce qu'ils sont autistes.

C'est là qu'intervient la nouvelle étude de Sharon et de ses collègues. Les chercheurs ont prélevé des échantillons de matières fécales d'enfants autistes et d'enfants témoins neurotypiques (non autistes) et les ont donnés à des souris "sans germes" - des animaux élevés dans un isolateur qui empêche l'exposition aux micro-organismes. Le fait de grandir sans bactéries (dont beaucoup sont saines et bénéfiques) signifie que ces souris ne sont pas des sujets de test idéaux. Les chercheurs ont donc élevé les souris en s'assurant de jumeler des souris mâles et femelles ayant le même "donneur" humain. Les descendants ainsi obtenus ont chacun reçu leurs bactéries intestinales d'un seul enfant humain. C'est cette deuxième génération de souris que les chercheurs ont testée.

C'est une conception ingénieuse car elle permet de séparer la cause et l'effet. Si les microbes intestinaux ne causent pas l'autisme, alors nous ne devrions pas nous attendre à ce qu'il y ait des différences dans le comportement des souris recevant leurs microbes de donneurs autistes et non autistes. Mais s'il y a des différences entre les deux groupes de souris - si les souris ayant des donneurs autistes ont un comportement plus autiste - c'est la preuve que les microbes intestinaux causent l'autisme ou du moins y contribuent.

La grande question, cependant, est de savoir comment mesurer l'autisme chez une souris.

La caractéristique principale de l'autisme est la déficience dans les interactions sociales. Cela peut se manifester de différentes manières, allant de la gêne sociale à l'évitement presque total de l'interaction avec d'autres personnes. Mais si les chercheurs affirment que leurs souris ont montré des "comportements autistiques caractéristiques", nous devons nous attendre à des preuves solides de comportement social réduit ou atypique.

Sharon et ses collègues ont utilisé deux tests de sociabilité des souris. Dans le premier, la souris a été placée pendant 10 minutes dans une boîte à trois chambres. Une des chambres était vide, une autre contenait un objet inanimé et la troisième contenait une autre souris du même sexe. Il est intéressant de savoir combien de temps la première souris a passé dans la chambre contenant la deuxième.

Watch Sociability Tests in Mice in Study Examining Immune System's Role in Autism © HopkinsChildrens

Le graphique ci-dessous montre l'indice de sociabilité pour chacune des souris testées - le temps passé avec l'autre souris par rapport au temps passé avec l'objet inanimé. Des scores positifs indiquent que plus de temps est passé à être sociable.

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Chaque point représente une seule souris et ils sont disposés selon l'identité de leur donneur humain. Les encadrés indiquent la fourchette interquartile - essentiellement les 50 % du milieu des données. Il y a beaucoup de variations entre les souris individuelles, même avec le même donneur. Mais - contrairement aux prévisions - il n'y a pas de différence entre les souris avec des donneurs autistes et celles avec des donneurs non autistes.

Ce test particulier a été largement utilisé pour étudier les modèles animaux d'autisme, comme le souligne cette récente étude.

" Le test de préférence sociale à trois chambres a été développé par le groupe de Jacqueline Crawley spécifiquement pour évaluer les phénotypes de déficience sociale dans les modèles de rongeurs autistes (Kazdoba et al., 2016). Ce test est l'un des plus fréquemment utilisés dans les études portant sur des modèles de rongeurs atteints de TSA (Amodeo et al., 2012 ; Crawley, 2012 ; Schwartzer et al., 2013 ; Silverman et al., 2010 ; Wöhr & Scattoni, 2013)."

En tant que tel, l'absence d'effet dans l'étude actuelle est une preuve importante contre l'hypothèse selon laquelle les bactéries intestinales provoquent des "comportements caractéristiques de l'autisme". Cependant, elle ne justifie qu'une seule ligne dans le document, les données étant reléguées à un chiffre supplémentaire.

Après avoir échoué dans leur première tentative de trouver des preuves de déficience sociale, Sharon et ses collègues sont passés à un second test, qu'ils jugent "plus sensible". La souris a été placée dans une cage, d'abord seule, puis pendant 6 minutes avec une autre souris. Les chercheurs ont ensuite réalisé des vidéos de l'interaction pour l'approche sociale, l'agressivité et le comportement de toilettage.

Cette fois, la différence était significative : en moyenne, les souris ayant des donneurs autistes passaient moins de temps à approcher l'autre souris dans leur cage. Cependant, ce deuxième test de sociabilité n'a été administré qu'aux souris de 8 des donneurs - 5 enfants autistes et 3 témoins. Deux des témoins (N5 et C4) ont des données qui ne peuvent être distinguées des enfants autistes. Tout repose donc sur un seul donneur témoin (C1) avec des souris relativement sociables.

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Les difficultés de communication sont également une caractéristique essentielle de l'autisme bien que, là encore, il existe d'énormes variations entre les individus autistes. Certaines personnes ont peu ou pas du tout la parole. D'autres sont très verbales mais ont des difficultés à maintenir la conversation ou à utiliser la communication non verbale. Ainsi, dans les critères de diagnostic actuels, l'accent est mis sur les aspects sociaux de la communication, plutôt que sur la capacité linguistique elle-même.

Dans l'étude de Sharon et al., comme dans de nombreuses autres études sur l'autisme chez la souris, la communication a été évaluée en mesurant les vocalisations ultrasoniques (à haute fréquence). Les souris mâles ont été maintenues en quasi isolement pendant 3 jours. Puis, le quatrième jour, les chercheurs ont enregistré leurs vocalisations au cours d'une interaction de 3 minutes avec une souris femelle.

Les chercheurs ont rapporté que les souris avec des donneurs autistes ont vocalisé beaucoup moins que les souris avec des donneurs non autistes. Ce résultat est basé sur une comparaison des données de seulement 4 donneurs témoins et 5 donneurs autistes (à l'exclusion de ceux atteints d'un "TSA léger"). Comme seules des souris mâles ont été évaluées, le nombre de souris par enfant est inférieur à celui des autres tests.

Outre les troubles sociaux et de la communication, l'autre caractéristique essentielle de l'autisme est ce que l'on appelle les comportements répétitifs et restreints. Il peut s'agir de schémas moteurs stéréotypés tels que le battement des mains et le balancement, d'intérêts inhabituels et obsessionnels, et d'un besoin de structure et de routine stricte.

Ici, comme dans d'autres études, l'analogue de ces comportements humains chez la souris a été mesuré lors d'une tâche d'enfouissement de marbre. La souris a été placée dans une cage avec 20 billes de verre disposées sur une litière de copeaux de bois. Au bout de 10 minutes, les chercheurs ont enregistré le nombre de billes que la souris avait enterrées.

En moyenne, les souris avec des donneurs autistes ont enterré plus de billes que celles avec des donneurs non autistes. La différence était statistiquement significative lorsque les souris de donneurs atteints de "TSA léger" étaient exclues de l'analyse.

Les chercheurs ont également examiné les corrélations entre le comportement des souris et les caractéristiques de leurs donneurs autistes. Ils ont noté une relation significative entre l'enfouissement de billes et les scores sur l'ADOS - une évaluation diagnostique dans laquelle un clinicien interagit avec l'enfant dans une série d'activités conçues pour susciter un comportement autistique.

La figure ci-dessous présente les données des neuf donneurs autistes qui ont réalisé l'ADOS et dont les souris ont effectué la tâche d'enfouissement de billes (les couleurs représentent ici différents donneurs). Les enfants qui présentaient le plus de comportements autistiques ont donné leurs fèces aux souris qui ont enterré plus de billes.

Enfin, les souris ont effectué un test en plein air, au cours duquel elles ont été suivies pendant 10 minutes dans une arène carrée en plastique. Les chercheurs ont extrait 9 mesures différentes du comportement et ont rapporté que les souris avec des donneurs autistes avaient une "locomotion réduite" - elles ont parcouru une distance plus courte que celles avec des donneurs non autistes. Cependant, s'il y a un effet statistiquement significatif, il est clairement très faible.

Il n'est pas non plus évident de savoir dans quelle mesure la réduction de la locomotion est liée à l'un des comportements caractéristiques de l'autisme classique.

Sharon et ses collègues résument les résultats de ces tests comme suit :

"Nous rapportons ici que la colonisation de souris par des microbiotes intestinaux provenant de donneurs humains atteints de TSA, mais pas de contrôles de DT, est suffisante pour promouvoir chez les souris des comportements compatibles avec les principales caractéristiques comportementales des TSA."

Examinons donc les "caractéristiques comportementales essentielles des TSA" et voyons comment les preuves s'accumulent :

  • Dysfonctionnement social : Aucune preuve de réduction de la sociabilité dans le test des trois chambres.
  • Dysfonctionnement social : aucune preuve de sociabilité réduite dans le test d'interaction sociale directe, bien que tout cela semble dépendre d'un seul participant témoin.
  • Dysfonctionnement de la communication : Réduction des vocalisations ultrasoniques si les donneurs atteints de TSA léger sont exclus de l'analyse.
  • Comportements répétitifs et restreints : Comportement accru d'enfouissement de billes si les donneurs atteints de TSA léger sont exclus.

Les chercheurs affirment également que les souris présentant des donneurs avec TSA montrent une réduction de la locomotion lors du test en plein air. Même si cela est vrai, cela n'a aucun sens de se rapporter aux "caractéristiques comportementales fondamentales de l'autisme".

Compte tenu de la publicité accordée à cette étude, les preuves de son affirmation centrale sont remarquablement faibles. Les différences entre les souris avec des donneurs autistes et non autistes sont subtiles, si tant est qu'elles existent. Et il y a des raisons d'être sceptique quant à ces effets, même minimes.

1. Les souris ne sont pas de petits humains avec une queue

L'autisme est défini en termes de comportement humain. Ainsi, l'affirmation selon laquelle des souris ont montré un comportement "semblable à l'autisme" repose sur l'hypothèse que les comportements des souris étudiées sont en quelque sorte équivalents aux comportements qui définissent l'autisme chez les humains. Nous supposons, par exemple, que les vocalisations réduites des ultrasons sont analogues aux difficultés de langage et de communication rencontrées par les enfants autistes, ou que l'enfouissement de billes équivaut à des comportements et des intérêts répétitifs. Et ces hypothèses peuvent être fausses.

En toute justice, il ne s'agit pas d'une critique de cette étude en particulier. Il s'agit d'un défi pour tout chercheur qui tente d'étudier l'autisme par le biais du comportement des souris. Mais il est important de se rappeler que lorsque nous disons "comportement de type autiste", cela signifie en réalité "un comportement chez les souris qui peut être décrit en utilisant les mêmes mots que ceux que nous utilisons pour décrire l'autisme".

2. La taille de l'échantillon était minuscule, quels que soient les critères utilisés

Bien qu'un nombre impressionnant de souris aient été testées, les échantillons de matières fécales provenaient de 16 enfants seulement. Et pour de nombreuses analyses, l'échantillon était encore plus petit. La seule preuve de l'existence de troubles sociaux chez les souris est venue d'une comparaison entre 5 donneurs autistes et 3 donneurs témoins.

Comme l'a dit Derek Lowe dans son blog : "...le nombre infime de donneurs humains me fait vraiment réfléchir. Il va sans dire que le microbiome humain est très variable, d'une personne à l'autre, et j'ai du mal à croire qu'il s'agit (ou même qu'il peut s'agir) d'un échantillon représentatif".

Le but de l'étude est de nous dire quelque chose sur l'autisme. Les enfants autistes de cette étude représentent les enfants autistes en général. Les 3, 4 ou 5 enfants témoins représentent le reste de la population. Tout comme un sondage d'opinion ne prend tout son sens que lorsque les enquêteurs échantillonnent un grand nombre d'électeurs, il est prématuré de tirer de véritables conclusions d'une étude avec ce petit nombre de donneurs.

3. Les chercheurs ont fait preuve d'une grande souplesse dans l'analyse des données

Les analyses statistiques conventionnelles partent du principe que les tests que vous effectuez actuellement sont les seuls que vous avez effectués. Sans entrer dans les détails techniques, cela signifie que plus vous analysez de choses différentes et plus vous effectuez d'analyses différentes sur les mêmes données, plus il est probable que vous détectiez des effets parasites. Dans le cas présent, cela signifie qu'il faut trouver des différences "significatives" entre les souris de donneurs autistes et non autistes alors qu'il n'en existe aucune dans la réalité.

Sharon et ses collègues ont effectué de nombreuses analyses. Et ils ont eu beaucoup de choix :

  • Quelles mesures examiner pour chaque test
  • Quel type d'analyse effectuer
  • Traiter les enfants autistes comme un seul groupe ou séparer ceux qui présentent un "TSA léger".
  • S'il faut (et comment) transformer les données avant de les analyser

Les choix qu'ils ont faits sont probablement tous défendables. Mais chaque choix a été l'occasion de sélectionner l'analyse qui a donné l'effet recherché. Et cela augmentait la probabilité de trouver un effet qui n'était pas réel. Comme l'a fait valoir le neurogénéticien Kevin Mitchell, nous devrions vraiment attendre une réplication avant de prendre l'une des conclusions au sérieux.

4. Dans plusieurs cas, la manière dont les chercheurs ont trouvé des effets statistiquement significatifs n'est pas claire

Je ne suis pas la seule personne à regarder les données et à me demander comment les auteurs ont réussi à trouver un effet statistiquement significatif.

Certains commentateurs ont également tenté de reproduire les analyses décrites dans le rapport et n'ont pas trouvé d'effets significatifs.

L'explication la plus probable est qu'ils n'ont pas analysé les données exactement de la même manière que les chercheurs originaux.

Quelle que soit la manière dont ces divergences sont résolues, elles illustrent le fait qu'il y avait de nombreuses manières sensées dont les chercheurs auraient pu analyser leurs données, ce qui leur aurait donné des résultats moins favorables que ceux qu'ils ont déclarés.

L'affirmation centrale de cette étude est que les bactéries intestinales peuvent entraîner des symptômes de type autiste. Mais même si nous acceptons l'hypothèse selon laquelle les comportements des souris sont directement analogues aux comportements des autistes humains, les preuves sont à la fois faibles et incohérentes. Il est juste de dire, je pense, que les auteurs ont présenté les données sous leur aspect le plus flatteur.

Je me suis concentré ici sur les expériences demandant si les transplantations fécales ont un impact sur le comportement des souris. Mais ce n'est en fait qu'une petite partie de l'article. Sharon et ses collègues ont également fait état d'une série d'expériences visant à déterminer comment cela a pu se produire. Ces expériences ont consisté à étudier en détail le microbiome intestinal des humains et des souris, à analyser les métabolites produits par les bactéries intestinales chez les souris, puis à utiliser certains de ces métabolites dans des expériences, d'abord avec des souris vivantes, puis avec des tranches de cerveau de souris, et enfin avec des neurones individuels provenant de cerveaux de rats. Je suis loin d'être qualifié pour critiquer ces expériences. Mais l'inquiétude est qu'elles tentent d'expliquer un lien entre les bactéries et le comportement qui n'existe pas.

Cela ne veut pas dire que l'hypothèse sous-jacente est totalement exclue. Il reste possible qu'il y ait un lien de cause à effet entre les bactéries intestinales et le développement de l'autisme. Mais cette étude ne semble pas fournir les preuves nécessaires pour étayer cette idée.

  • Note : Tous les chiffres ont été créés dans Flourish que je recommande vivement (COI : Mon frère est l'un des développeurs de Flourish). Les données ont été téléchargées à partir de Mendeley.

Depuis la publication de cette critique la semaine dernière, d'autres développements ont jeté davantage de doutes sur les conclusions de cette étude. Les auteurs ont répondu aux critiques sur PubPeer. Ce faisant, ils ont publié le code de leurs analyses, qui semblent montrer d'importantes divergences entre la manière dont les analyses ont été décrites dans le document et la manière dont elles ont été réellement menées.

C'est au professeur Thomas Lumley, biostatisticien à l'université d'Auckland, en Nouvelle-Zélande, que revient le mérite d'avoir découvert ces divergences. Dans un billet de blog rédigé au cours du week-end, il a expliqué ce que les chercheurs ont dû faire pour obtenir les résultats qu'ils ont présentés. Ses conclusions ont ensuite été confirmées lorsque les auteurs ont publié leur code.

Essentiellement, les auteurs ont laissé entendre que leurs analyses tenaient compte (correctement) du fait que les échantillons de matières fécales provenaient d'une poignée d'enfants, chacun agissant comme donneur pour des dizaines de souris. Mais M. Lumley affirme que le code qu'ils ont publié a (incorrectement) traité chaque souris comme si elle avait un donneur unique. C'est important. Par exemple, dans le test d'interaction sociale directe, il y avait 128 souris au total qui recevaient des fèces de 8 donneurs. Mais l'analyse menée par les chercheurs a imaginé une situation avec 128 donneurs - un pour chaque souris. Cela a conduit les auteurs à conclure que les souris ayant des donneurs autistes présentaient une sociabilité réduite lors de ce test particulier. Lorsque M. Lumley a ré-analysé les données en utilisant un modèle plus approprié, l'effet a disparu.

Cela change radicalement les conclusions de l'étude. L'analyse correcte des données (et conforme à la description des auteurs dans le document) signifie que tous les effets signalés dans le document, sauf un, disparaissent. Il n'y a aucune preuve de réduction du comportement social chez les souris ayant des donneurs autistes, que ce soit au test des trois champs ou maintenant au test d'interaction sociale directe. Il n'y a pas de réduction de la vocalisation ultrasonore. Pas de réduction de la locomotion. Le seul survivant est un effet à peine significatif de l'augmentation de l'enfouissement de billes. Cela met l'analyse statistique en accord avec les intuitions de la plupart des personnes qui examinent ces données. Il n'y a rien là.

Lumley soupçonne que le coupable est l'interface confuse du logiciel SPSS que les auteurs ont utilisé pour leurs analyses. Il n'y a aucune raison de voir cela autrement que comme une erreur honnête. Mais, comme le note Lumley dans son post, l'épisode montre l'importance pour les chercheurs de partager leur code d'analyse ainsi que leurs données.

Bien sûr, toutes les préoccupations exposées dans mon billet original et par d'autres commentateurs tiennent toujours. Mais la conclusion selon laquelle les bactéries intestinales contribuent à des comportements semblables à ceux de l'autisme ne tient plus qu'à un fil : un groupe de souris enterre un peu plus de billes qu'un autre groupe de souris. Pour reprendre la conclusion de l'article original, il est toujours possible que les bactéries intestinales puissent, dans certaines circonstances, contribuer au développement de l'autisme. Mais nous ne devrions pas considérer cette étude particulière comme un soutien à cette idée.

Note de bas de page : Dans son article, M. Lumley a réanalysé les données de la figure 1 de l'article sur les cellules. Il s'est concentré sur 8 enfants (5 autistes) dont les souris et les fèces ont fait l'objet d'analyses détaillées. Dans mon premier article, j'ai travaillé à partir d'un ensemble de données plus large

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